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新型乳酸固定化酶荧光毛细生物传感器

成都世纪方舟科技有限公司2011年2月28日 14:14 点击:1696

新型乳酸固定化酶荧光毛细生物传感器

20090520 13:32:12 Wednesday

作者:李永生 鞠香 高秀峰* 杨微 作者单位:四川大学化学工程学院,四川大学基础医学与法医学院

【摘要】    对长45 mm、内径0.9 mm的医用毛细管进行γ氨丙基三乙氧基硅烷氨基化和戊二醛醛基化后,再将乳酸脱氢酶(LDH)的氨基与戊二醛的醛基结合,使其固定在毛细管内壁,构成一种新型固定化酶乳酸荧光毛细生物传感器(IELFCBS),实现了对乳酸的微量、快速测定。IELFCBS吸入辅酶Ⅰ与乳酸的混合液,在固定化酶催化下使乳酸与辅酶Ⅰ反应,生成荧光物质还原型辅酶Ⅰ;激发波长353 nm、发射波长466 nm。适用于IELFCBS的优化条件为:辅酶Ⅰ浓度4 mmol/L、用于固定化的LDH浓度60 kU/L、反应时间15 min、反应温度38 ℃、测定范围为1.05.0 mmol/L、回收率95%98%IELFCBS的相对标准偏差为RSD<1.5%(n=11),检出限为0.45 mmol/LIELFCBS的试液用量极少(18 μL),并能重复使用,可望用于发酵食品、药品、血液标本等各类样品中乳酸的快速检测。

【关键词】  固定化酶 荧光毛细分析 还原型辅酶Ⅰ 乳酸 生物传感器

引言

乳酸在机体内所有组织中都可产生,是体内糖无氧酵解的最终产物。乳酸中毒是代谢性酸中毒最常见的类型之一,表现为血中乳酸值增高,例如贫血、白血病、心肌梗塞、急性肝萎缩、糖尿病等的血浆乳酸值升高。生物样品中乳酸的测定对这些疾病的诊断具有重要的参考价值[1]。乳酸也是酒中一种重要的有机酸。在浓香型白酒中,它的含量仅次于己酸。其含量的多少,不但对白酒的口味和后味有较大影响,而且也直接反映了酒醅在发展过程中是否正常。因此,测定白酒中乳酸的含量对酿酒业有重要意义[23]。此外,在运动医学中,合理地安排运动量及评价运动员无氧代谢和有氧代谢能力时,也需要一种能够快速、准确测定血乳酸盐的特殊手段[4]
   
目前,国内外各种样品中乳酸含量测定方法有气相色谱法(GC) [5]、高效液相色谱法(HPLC) [67]、酶法[89]、酶传感器法[1012]、荧光法[1315]及流动注射分析法(FIA) [1617]等。其中酶法和酶电极法操作简单、分析速度快、选择性好、灵敏度高,使用较为广泛,但酶的用量大、成本高;HPLCGC法存在单个样品分析时间长,色谱柱易污染,不便携带,不适合现场的快速检测等缺点;固定化酶FIA法,具有快速、简便、酶利用率高的特点;常规的荧光光度法灵敏度虽高,选择性好,但目前应用不广泛。
   
荧光毛细分析法(FCA) [18],用一个专用支架和常规医用毛细管替代传统的荧光池,毛细管既是被测液容器、反应容器,又是酶、基因探针或试剂的固定化载体。FCA真正实现了微量样品的微量分析,大大减少排废污染,使荧光光度法更加实用化、普及化。基于FCA法已成功测定了酒中乙醇[19]、血清中丙酮酸[20]、尿中磺酸化胆汁酸[21]、靶核苷酸[22]等,本研究基于FCA和固定化酶技术,研制了一种测定乳酸的毛细生物传感器(immobilization enzyme lactate fluorescence capillary biosensor, IE
LFCBS)

  实验部分

  2.1  仪器与试剂
    F
4500荧光分光光度仪(日本日立公司)AUW120D电子天平(日本岛津公司)、PXJ1C+离子活度计(成都世纪方舟科技有限公司);毛细管定位座(自制)。18 μL玻璃毛细管(华西医科大学仪器厂)。
   
所用的酶试剂有氧化型辅酶Ⅰ(nicotinamide
adenine dinucleotidNAD+); 还原型辅酶Ⅰ(reduced form of nicotinamideadenine dinucleotidNADH)(日本酵母工业株式会社); 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH5 kU/94 mg Sigam公司)JHA110硅烷偶联剂(98%, 荆州市江汉精细化工); 戊二醛(重庆北培化学试剂)、乳酸(成都科莱公司)。所用试剂均为分析纯。本实验用水均为超纯水(0.065 μS/cm)。
   
  0.1 mol/L磷酸缓冲液(PBS):取100 mL 0.1 mol/L Na2HPO4溶液,用0.1 mol/L KH2PO4溶液调pH7.5,室温保存;0.1 mol/L Tris
HCl缓冲液:准确称取6.055 g Tris碱,溶于430440 mL去离子水中,边搅拌边加NH4Cl,调节至实验所需pH值,然后加水定容至500 mL,室温保存;2.5%戊二醛溶液:量取2.5 mL戊二醛(50%,V/),移入50 mL容量瓶中用水定容,摇匀后倒入试剂瓶,常温下保存;50 mmol/L乳酸储备液:称取0.125 g乳酸(85%90),用Tris盐酸缓冲液(pH 8.8)定容至25 mL100 kU/L LDH母液:准确称取2.0 mg LDH(5 kU/94 mg),使用Tris盐酸缓冲液(pH 8.8)稀释至1.0 mL10 mmol/L NAD+ 母液:准确称取6.6 mg NAD+, TrisHCl缓冲液(pH 8.8)定容至1.0 mL4%(/) γ氨丙基三乙氧基硅烷溶液配制:取1.0 mL γ氨丙基三乙氧基硅烷溶液(98%)于25 mL容量瓶中,用正己烷稀释定容。

  2.2  酶的固定化及测定过程
   
  酶固定化前,用2 mol/L NaOH的乙醇溶液清洗毛细管的内外管壁,再用超纯水清洗,最后放入隔水式电热恒温培养箱在40 ℃下烘干待用。
   
  将预处理好的毛细管,在一定温度下用JH
A110溶液浸泡数小时;再用PBS缓冲液(pH 7.0)冲洗,完成毛细管氨基化;在真空状态下,用2.5%戊二醛浸泡氨基化毛细管1 h(戊二醛容易被氧化); 再用PBS 缓冲液(pH 7.0)洗除未结合的游离戊二醛, 完成毛细管醛基化;毛细管吸入PBS缓冲液配制的LDH溶液,静置过夜(12 h), 毛细管壁上的戊二醛醛基与LDH的氨基结合,构成IELFCBS。将IELCBSPBS缓冲液(pH 7.0)冲洗,再用TrisHCl缓冲液(pH 7.0)浸泡1 h左右,封闭IELFCBS上多余的醛基, 最后将其保存在PBS缓冲液(pH 7.0)中。
 
  图IE
LFCBS测定乳酸的示意图(略)

  Fig.1  Illustration of immobilization enzyme lactate fluorescence capillary biosensor(IELFCBS) for the determination of lactate

  S. 样品(sample); 1. 荧光反应液(fluorescence reaction solution); 2. 固定化酶乳酸生物传感器(IELFCBS); 3. 毛细管壁(capillary wall); 4. 硅烷偶联剂; 5 1,5戊二醛(glutaraldehyde); 6. 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH); 7. 反应混合液(reaction mixture solution)   

  2.3  测定原理及过程
   
  在LDH的催化作用下,乳酸和NAD+反应生成丙酮酸和荧光物质NADH,通过检测NADH的荧光强度来间接定量乳酸。
   
  IE
LFCBS的使用过程如图1所示。在两个1.5 mL EP管中,分别加入40 μL NAD+溶液、050 μL乳酸标准液,最后再分别加入TrisHCl缓冲液,使其总体积达到100 μL。在EP管中混合均匀后,将荧光反应混合液吸入IELFCBS中;IELFCBS两端用橡胶帽堵住,再放入小试管内,在38 ℃水浴中反应15 min后,将IELFCBS插入毛细管定位座中,在荧光仪上测定其荧光强度。其中,不含乳酸标准液的荧光强度为试剂空白(F 1),含乳酸标准液的反应混合液荧光强度为测定值(F2),用ΔF=F2F 1定量乳酸浓度。
   
  从测定原理可知,NADH是测定乳酸过程中的重要环节。所以,对NADH的波长进行了扫描。在室温下用400 mg/L NADH溶液作为试样吸入毛细管,在荧光仪上进行测定。结果表明,NADH的最大激发和发射波长分别为353 nm466 nm
   
  随后,用FCA法对同一系列不同浓度的NADH标准液进行测定。由实验结果可知,NADH浓度在090 mg/L范围内与荧光强度有良好的线性关系,ΔF=0.159CNADH0.2862, r=0.9976

  结果与讨论

  3.1  氨基化试剂浓度及LDH固定化浓度对荧光强度的影响
   
  先将乳酸/LDH/NAD+体系的反应条件固定为:反应时间15 min, 反应温度38 ℃,NAD+浓度4 mmol/LTris
HCl缓冲液(pH 8.8)。以1 mmol/L2 mmol/L的乳酸标准液为被测样品,分别用1%2%4%10%20%40%(/, 正己烷稀释)JHA110进行毛细管氨基化后,制作成6IELCBS,并分别吸入乳酸标准液进行荧光测定。结果表明,当JHA110浓度为4%时,IELCBS的荧光强度达到最大值。因此,用于固定化的JHA110浓度选为4%。 

  图2  用于固定化的LDH浓度对荧光强度的影响(略)

  Fig.2  Effect of LDH concentration used for immobilization on fluorescence intensity

  1. lactate 1.0 mmol/L; 2. lactate 2.0 mmol/L.
   
  LDH作为乳酸/NAD+氧化还原反应体系的催化剂,其用量的多少对催化反应有一定的影响。所以,对LDH的固定化浓度进行了优选。除JH
A110浓度为4%外,其它实验条件及操作过程同3.1。先用不同浓度的LDH51020406080 kU/L)制成6IELFCBS,再用这些IELFCBS分别吸入含乳酸标准液的相同反应混合液,测定其荧光强度。从图2可见,当LDH浓度小于60 kU/L时,IELFCBS的荧光强度随LDH浓度的增加而增加;当LDH浓度超过60 kU/L时,IELFCBS的荧光强度不再发生变化。因此,实验选择固定化的LDH浓度为60 kU/L

  3.2  NAD+浓度及反应体系酸度对荧光强度的影响
   
  除用于IE
LFCBS固定化的LDH浓度为60 kU/L外,其它实验条件同3.1。分别改变IELFCBS中乳酸/固定化LDH/NAD+反应体系的NAD+浓度(1.02.03.04.05.06.0 mmol/L),其荧光强度随NAD+浓度提高而缓慢增大,NAD+浓度为4.0 mmol/L时,荧光强度最大。因此,NAD+浓度选为4.0 mmol/L
   
  NAD+浓度设定为4.0 mmol/L,用不同pH值的Tris
HCl缓冲液配制反应混合液,测定IELFCBS中反应混合液的荧光强度,间接地考察了pH对固定化酶催化反应体系的影响。结果见图3。当反应体系的pH值为8.8时其荧光强度达到最大值;当pH>8.8,其荧光强度值有所降低。所以,反应混合液的pH值定为8.8

  3.3  反应时间和温度对荧光强度的影响
   
  在不同的反应时间(051015203040 min),测定IE
LFCBS中反应混合液的荧光强度值。从图4可知,当反应体系的反应时间在1520 min时,荧光强度较大;当反应时间超过20 min后,反应体系的荧光强度随时间的增加不再有变化。所以,考虑到尽量缩短测定时间,本实验将反应时间选为15 min
     
  图反应混合液酸度对荧光强度的影响(略)

  Fig.3  Effect of acidity of mixed solution on fluorescence intensity

  1. 1.0 mmol/L lactate; 2. 2.0 mmol/L lactate. 

  图反应时间对荧光强度的影响(略)

  Fig.4  Effect of reaction time on fluorescence intensity(LDH: 60 kU/L)

  1. 1.0 mmol/L lactate; 2. 2.0 mmol/L lactate.

  通过测定不同温度下IELCBS中反应混合液的荧光强度,考察了反应温度对反应体系的影响。除反应时间为15 min外,其它实验条件同上。得到的结果表明,在38 ℃时,IELFCBS中的荧光强度达到最大值;当超过38 ℃时,荧光强度开始降低。温度升高虽能使酶的活力增大,使酶促反应速度加快;但温度过高时,由于酶蛋白的热变性致使酶逐渐失活,使反应速度反而下降,导致荧光强度降低。因而,本实验的反应温度选用38 ℃。

  3.4  LDH的状态对乳酸测定的影响
   
  为了考察在液态和固定化状态下LDH的催化效果,本实验基于IE
LCBS和液态酶FCA法,分别对一系列不同浓度(0.511.52 mmol/L)的乳酸标准液的荧光强度进行了测定。实验条件:IELCBS中的 LDH的固定化浓度为60 kU/L;液态酶FCA法中使用的LDH浓度也是60 kU/LNAD+浓度均为4.0 mmol/L。得到的IELFCBS和液态酶FCA法的乳酸标准曲线的线性方程分别为:ΔF(IELFCBS) = 4.7093C乳酸 -0.0842(r=0.9993)ΔF(液态酶FCA)=3.086C乳酸 +0.19(r=0.9951)。从方程的斜率可以看出,IELFCBS测定乳酸时,其灵敏度大于液态酶FCA法。

  3.5  IELFCBS储存稳定性考察
   
  将IE
LFCBS中用于固定化的LDH浓度定为60 kU/L,考察了IELFCBS的稳定性。IELFCBS的稳定性指标用酶活性比表示。将刚制成的IELFCBS的酶活性比设为100%,储存不同时间的IELFCBS酶活性比按IELFCBS酶活性比=F′/Fo计算。其中,Fo为刚制成的IELCBS的荧光强度;F′为储存不同时间的IELFCBS荧光强度。 

  图5  IELBCS的稳定性实验(略)

  Fig.5  Stability test of IELBCS

  1. 1.0 mmol/L lactate 2. 2.0 mmol/L lactate.
   
  同时制作10IE
LFCBS,保存在4 ℃下的PBS缓冲液(pH 7.0)中。然后分别在不同的时间测定这些IELFCBS的荧光强度值,结果如图5所示。随着IELFCBS储存时间的延长,其荧光强度呈逐渐减弱,到30 d时,IELFCBS中的LDH活性比衰减约50%。

  3.6  标准样品和实际样品测定
   
  综上可知,适合于IE
LCBS的优化条件是:激发波长350 nm,发射波长460 nm,入射光和出射光的光谱带宽分别为10 nm20 nm; 用于固定化的JHA110浓度为4%LDH浓度为60 kU/LNAD+浓度为4.0 mmol/L,反应时间为15 min,反应温度为38 ℃。在优化的实验条件下,用IELFCBS 分别测定了不同浓度的乳酸标准液。在1.05.0 mmol/L, 其线性相关方程为ΔF=30.931C乳酸-1.6202(r=0.9930)
   
  由于酸奶成分复杂,可能存在着一些对乳酸/LDH/NAD+反应体系有干扰的物质。为了预先消除这些干扰,首先对酸奶样品的预孵温度和时间进行了考察。在酸奶样品中不加LDH,只按比例加入NAD+/Tris
HCl混合液,固定反应时间为15 min,改变反应体系温度(2538608090100 ),观察荧光强度的变化。结果发现,当温度达到80 ℃时,体系荧光强度趋于恒定;然后,在此温度下改变反应时间(0410202530 min),观察其荧光强度的变化。结果表明,当达到10 min后,反应体系的荧光强度趋于恒定,所以酸奶样品的预孵时间和温度选定为10 min80 ℃。
   
  用IE
LFCBS3种市售酸奶中的乳酸含量进行了测定。测定前将酸奶预孵,然后以2000 r/min转速离心30 min,取上层清液作为试样母液。实际测定时,对母液将按不同的比例稀释。各种酸奶中乳酸含量的测定结果见表1

  表IELFCBS对酸奶中乳酸含量的测定结果(略)

  Table 1  Determination of lactate concentration in madzoons by IELCBS

  F1: 试剂空白的荧光(fluorecence of blank; F2: 样品液荧光(fluorecence of sample); ΔF=F2-F1。

  3.7  回收率测定和对比实验
   
  为了检验IE
LFCBS的准确性,在乳饮料试样中分别添加不同乳酸标准液,配成高、中、低3个浓度,进行了回收率的测定。由表2可以看出,样品的添加回收率在95%98%之间,结果令人满意。另外,用商品化的乳酸/LDH/NAD+/PMS/NBT比色测试盒(南京建成生物工程研究所),对上述的酸奶样品中乳酸含量进行测定,发现两种方法测定结果一致(r=0.996)。这证明IELCBS 可靠,能用于乳酸的定量分析。
   
  为了考察IE
LFCBS的精密度,在乳酸浓度的线性范围内,分别对2.0 mmol/L(: 352.7; 标准偏差: 4.62)5.0 mmol/L(: 473.1; 标准偏差: 3.90)的乳酸标准液重复测定11次。结果表明,IELFCBS的相对标准偏差(RSD)在0.83%1.31%范围内,即其精密度已满足测定需要。以3倍标准偏差计算IELFCBS 的检出限为0.45 mmol/L

  表回收率测定(略)

  Table 2  Determination of recovery

  研究结果表明,建立的毛细管生物传感器方法,实现了乳酸脱氢酶循环使用,达到节约贵重的酶试剂,降低实验成本,便于携带,利于普及推广的目的。

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(来源: 成都世纪方舟科技有限公司


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