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张锋团队带来第三款CRISPR基因组编辑系统,显著减少脱靶效应

学术经纬2019年1月23日 8:59 点击:1059

今日,CRISPR-Cas基因编辑系统的先驱之一张锋教授在《自然》子刊《Nature Communications》发布一项重要进展,报告了第三个可以编辑人类细胞基因组的CRISPR-Cas系统:CRISPR-Cas12b


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多功能基因组编辑系统CRISPR-Cas的问世,掀起了一场生物技术革命。在科学研究和医疗研发方面,这套基因编辑工具得到广泛应用,以此为基础的基因编辑疗法也展开临床试验,在治疗人类遗传病方面初现潜力。


这一系统中的“元老”成员就是我们已经熟悉的Cas9。不过Cas9也并非没有限制,比如切割非靶点序列的脱靶效应就是一个问题。鉴于CRSPR-Cas系统在微生物中广泛存在,科学家们将Cas蛋白的类型范围不断扩大,寻找新秀,例如Cas12a。


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2017年1月,张锋教授与NIH两位科学家在《Cell》发文,详细归纳了2类CRISPR系统的特点和作用机制(图片来源:参考资料[2])


在与Cas9、Cas12a同属2类CRISPR系统的Cas蛋白中,还有一个富有潜力的成员,就是Cas12b(过去被称为C2c1)。Cas12b蛋白比Cas9和Cas12a更小,因此更容易通过病毒载体实现细胞间递送


虽然有这样的优势,Cas12b的开发却遇到了一个阻碍。性能最佳的Cas12b来自一种嗜酸耐热菌(Alicyclobacillus acidoterrestris),但它作为DNA裂解酶的最佳活性需要高达48℃。也就是说,如果放进哺乳动物细胞内,达不到这种Cas12b的温度要求,酶活性就不能发挥。怎么“解锁”这种Cas蛋白呢?


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▲Cas9、Cas12a、Cas12b三种核酸酶的基因序列模式图和蛋白质结构示意图(图片来源:参考资料[1])


为了适用于人类基因组编辑,张锋教授和同事们首先在Cas12b蛋白家族中寻找喜欢常温的成员。最终,根据同源序列比对,他们从一种叫作外村尚芽孢杆菌(Bacillus hisashii)的细菌中鉴定出了在人体体温(37℃时)能保持核酸酶活性的BhCas12b。并且,研究人员还通过调整指导RNA(sgRNA)的结构,让Cas12b的效率得到大幅提升。


可是,新的问题来了。体外切割实验发现,原始结构的Cas12b在DNA双链断裂时会切割非靶标单链,并且温度越低,这种错误发生得越多。为了解决这个问题,研究者对Cas12b进行了工程改造根据蛋白质晶体结构的线索,研究人员通过4个点突变,得到了重新设计的新Cas12b,让酶的活性位点更容易和DNA靶序列接近。


经过重新设计的Cas12b,基因组编辑的潜能如何呢?在细胞培养实验中,研究人员针对多个基因的多个靶序列考察了Cas12b的编辑效率。对随机引入插入缺失的分析结果显示,新的Cas12b的编辑效率与Cas9和Cas12a相当、甚至更高,足以在人体细胞中作为可编程的基因组编辑工具


除了有效性,特异性对于一款强大的基因组编辑工具来说也非常重要。这一点,研究团队也在人类细胞中利用GUIDE-seq技术对全基因组范围内的脱靶效应进行了检测。结果表明,相比常用的Cas9,Cas12b导致的错误插入缺失都要少得多,脱靶性显著降低


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▲GUIDE-seq分析显示,重新设计的Cas12b没有出现Cas9那样的脱靶效应(图片来源:参考资料[1])


研究团队相信,在继Cas9和Cas12a之后改造的Cas12b将以其分子量小和靶向特异性高的两大特点,成为又一款在体编辑人类基因组的有力工具。并且,这一显著提升Cas12b效率的改造工程也为解锁更多CRISPR工具提供了富有启发的指导。


我们再次祝贺张锋教授团队给CRISPR领域带来的新突破!


本文题图来自123RF

参考资料

[1] Jonathan Strecker, et al., 2019, Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing. Nature Communications. DOI: 10.1038/s41467-018-08224-4

[2] Kira Makarova, et al., 2017, SnapShot: Class 2 CRISPR-Cas Systems. Cell, DOI: 10.1016/j.cell.2016.12.038


(来源: 学术经纬 )


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