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如何选择合适的流式抗体???

上海优宁维生物科技有限公司2014年7月22日 9:18 点击:988

 随着流式细胞术应用领域的日益广泛,及荧光标记产品的种类、数量也在不断增多,加上多色分析实验方案需求的增长,逐渐产生了抗体难选择、荧光难搭配等问题,给实验顺利开展带来了诸多困扰。流式抗体如何选择,也成为了流式技术是否能被成功应用的关键因素之一。如何从众多的流式厂商中筛选出最适合您的抗体,教给您方法(或加入流式微信公众号:微信搜索 >流式专家 或 UNIV-FCMsolution): 
 
第一:满足所需抗体的基本要求(抗原、识别种属、能用于流式实验)

① 目标蛋白特异性:确定目的细胞的特异性表面标记或者胞内标记,确定检测指标;
 
② 识别种属:严格按照样本种属来源进行选择,流式抗体基本无法进行种属交叉反应;
 
③ 可用于流式实验 ,说明书中明确标注经FC 实验测试,最好有实验数据图和用量说明 ;

在查询抗体时这三要素是抗体查询必需填写项,下面是正确示范案例图1(参考高级查询)


第二:确定流式细胞仪的配置(激光器+探测器)


图二


任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱:第一个是激发光谱(Excitation,Ex): – 是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范 围内的光线,也称为吸收光谱。 – 吸收波峰(最大吸收波长)。 第二个是Ex-Max 发射光谱(Emission): – 是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波 长范围内的荧光。 – 发射波峰(最大发射波长):Em-Max 发射波峰--最大发射波长。(如图2)


那么荧光素跟我们的流式抗体选择有什么关系?

在设计流式配色方案前,根据可能需要同时检测指标的多少,先确定需要在哪台流式细胞仪上机检测,对该仪器的参数配置,要了解以下几个方面信息:
 
① 激发器:常见的流式细胞仪有 405,488nm 和 635nm 三个激光器,不同流式仪器激光器配置不同,但有些机器在购买时只装了一个激光器,需要注意的是,型号相同的机器也未必激光配置相同;激光器是跟荧光素的激发波长相关,所选择荧光素一定是流式仪器激光激发范围内的。
 
②滤光片:也就是有流式仪器上几个检测通道,这决定了最多可以同时检测多少个指标;荧光素的发射波长是跟滤光片有关,发射波长一定是要在流式仪器的检测范围之内。
 
③仪器的具体型号:再次确定检测通道。因为同一个荧光在不同的流式细胞仪上检测有时候检测通道也是不一样的。

 比如BD Calibur是双激光四色,配置的激光器和能够检测的通道详细如下(表1):

 

激光器 检测通道 滤光片配置 滤光片检测发射波长 在检测范围之内的荧光素
488 FL1 BP 530/30 515-545 FITC、AF488、GFP
FL2 BP 585/42 564-606 PE
FL3 670 LP ﹥670 PE-Cy5、PerCP、PE-Cy7
635 FL4 BP 661/16 653-669 APC、AF647


第三: 荧光抗体的选择建议

  流式检测的抗体必须要求都有荧光标记,在选择过程中可参考以下几方面建议

① 荧光标记:流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。间接标记二抗会增加实验步骤,清洗多次造成细胞浪费,会影响实验的准确性,所以在流式实验过程中,为了尽量减少实验工序和过程,以保证实验的真实和准确性,建议尽量用直接标记的抗体进行实验而不去做间接标记。


② 高表达的抗原可用不太“亮”的染料,更“亮”的荧光素分配给表达低的抗原:荧光本身有强弱之分,可视抗原表达强弱及分群情况选择合适的荧光。如抗原表达弱或分群不明显的建议选择强荧光 PE ;反之,抗原表达强或分群明显的建议选择最常用的弱荧光 FITC 即可(常用荧光强弱排序为:PE>APC>PE-cy5>Percp-cy5.5>FITC );更多荧光素的强弱比较如图3,stain index(SI)染色指数越高,荧光素越强。

比如: Treg的检测常用指标是CD4,CD25和FOXP3,CD4表达较多,所以使用不太亮的荧光素FITC,CD25和FOXP3表达较低,所以使用较强的荧光素APC和PE,配色如下
CD4-FITC、
CD25-APC、
FoxP3-PE


第四:流式多色分析荧光搭配的原则

  很多实验需要同时检测多个指标,比如同时检测CD3 CD4 CD8  IFN-gamma IL-4等,就需要给每个指标搭配不同的荧光素以便分析,多色分析方案中荧光抗体的选择和搭配,
需要考虑多种因素,怎么能够非常好的搭配呢?优宁维公司有如下建议供大家参考:
 
① 每个检测通道只能选择 一 种荧光素:各通道之间的荧光素可以随意搭配 (比如使用仪器是calibur, 在进行双标实验时,FL1 选择了 FITC 标记的抗体,就不能再选择 Alexa Fluor488 标记的抗体;而同组实验的其余抗体选择 PE 或者 APC 标记,都是可以随意组合的);

②选择光谱重叠小的染料:由于荧光素的宽发射谱特点,荧光通道间有光谱重叠现象。多色流式实验的时候需要通过补偿调节消除光谱重叠影响。(如图4:FITC和PE有重叠)所以选择所选各种荧光素光谱的重叠应当尽量减少,例如,PE-cy5 与 APC 同时标记,将会导致补偿过度,需换成 PE-cy5.5 或 Percp-cy5.5。最常用的4 色荧光搭配是:FITC、PE、Percp-cy5.5、APC ;

 

③ 多色分析往往会因个别抗体荧光素种类极少而受到限制,需要同时参考多家抗体公司的产品进行方案设计。因此如遇 5 色以上分析需求,建议咨询我们公司专业人员。
 
第五:抗体的使用与保存(尽为参考,请尽量参见厂家产品说明书)


1、抗体使用的建议
① 建议实验细胞的数量和抗体的比例要适当。细胞过量或抗体过量都可能使实验结果受影响,因此需要优化试验条件。注:不同的流式技术对抗体的需求量有较大差异,例如传统流式细胞术 (采用鞘液流系统)需要1×106个细胞为起始上样量,抗体用量为10μl,而微流式细胞术则只需5×105个细胞,抗体用量减少到5μl。
② 以test 为计量单位的抗体,按照总体积计算出每次加入多少 ul 抗体即可;
③ 以 ug 为计量单位的抗体,需要根据说明书每次抗体加入多少 ug 先算出能使用的次数,再通过总体积算出每次加入多少 ul 抗体。

2、直标的流式抗体应该4℃避光保存,不要冻。 不用本金就能赚钱的方法                           

 
第六:同型对照抗体的选择

同型对照 (Isotype Control ),是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞PE-Cy5、PerCP、PE-Cy7 表面而产生的背景染色,是真正意义上的流式阴性对照。它不但可以用来设定流式细胞仪的电压,而且还可以帮忙省去繁琐的竞争封闭步骤。

同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型及亚链、相同荧光标记的免疫球蛋白,也要求使用相同剂量.比如同时做CD3和CD4双标检测,对应流式一抗信息与同行对照信息如下,要注意的是:几色分析就需要制备几个补偿对照管:
 

No. Antibody Isotype
1 Anti human CD3-FITCmouse igg1 Mouse igg1-FITC
2 Anti human cd4 -PEigg2a Mouse igg2a-PE


如果是纯化的一抗加荧光标记的二抗,那么应该选择与一抗相对应的同型对照抗体(如样品管为 :纯化的 CD3+PE 标记的二抗+样本;则对照管为 :纯化的同型对照+ PE 标记的二抗+样本);

No. Antibody Isotype
1 Anti human CD3 puremouse igg1 +anti mouse igg -PE Mouse igg1+anti mouse igg -PE


有些抗体在细胞表面或胞内表达不高,而跟其类似的抗原却非常多,那么同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性,就会造成同型对照表达高于抗体阳性表达的现象。这时推荐使用其他阴性对照,如空白对照等。

 
有任何流式抗体选择问题借鉴了很多优秀流式技术人员的经验,希望大家能够多提建议,让流式抗体选择不再困难。如果您在流式抗体选择中遇到了疑问,可以咨询优宁维公司(4006-365-264或者
FCM@univ-bio.com)。我们会陆续介绍不同的关于如何选择合适的流式抗体的总结文章''供您多角度去了解和理解'' 更加全面和深刻.
   
针对客户难题,优宁维提供了免费荧光配色服务,让流式不再成为困扰。



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