不用本金就能赚钱的方法

来宝网Logo

热门词:生物显微镜 水质分析仪 微波消解 荧光定量PCR 电化学工作站 生物安全柜

现在位置不用本金就能赚钱的方法>技术资料不用本金就能赚钱的方法>行业动态>新品动态>干货┃TaqMan qPCR实验您至少需要了解这些!

干货┃TaqMan qPCR实验您至少需要了解这些!

上海翊圣生物科技有限公司2020年1月3日 2:08 点击:152

干货TaqMan qPCR实验您至少需要了解这些!

提到实时荧光定量PCR(简称qPCR,想必大家都很熟悉,它是指在PCR反应体系中加入荧光化学物质利用荧光信号积累实时监测PCR扩增产物并进行定量分析的方法。根据所用荧光化学物质不同,qPCR分为荧光染料法(SYBR Green 法为代表)和荧光探针法(TaqMan法为代表)。

SYBR Green Ⅰ染料因具有使用简便,价格便宜等优点而被广泛使用。但其最大的缺点是缺乏特异性,即染料可以与任何dsDNA结合。因此,qPCR反应中有非特异性扩增产物的出现会增加荧光值影响定量结果的准确性,而TaqMan探针的出现解决了染料法非特异性的问题。下面,我们一起来了解一下TaqMan 探针法qPCR

TaqMan 探针qPCR原理

TaqMan探针法qPCR是使用TaqMan荧光探针进行荧光检测的方法。那什么是TaqMan荧光探针呢?它是一段序列特异的、荧光标记的寡核苷酸,其5’端标记一个报告荧光基团(ReporterR),一般为FAMVICHEXTET等荧光基团,3’端标记一个淬灭荧光基团(QuencherQ),一般为TAMRAMGB等。

QQ图片20200103140202.png 

图:TaqMan 探针图示。R为报告荧光基团,Q为淬灭荧光基团,中间连接的表示核苷酸。

TaqMan探针法qPCR的原理是在PCR扩增时加入一对引物的同时另外加入一条特异性的TaqMan荧光探针,该探针与模板特异性地结合,其结合位点在两条引物之间。

当探针完整时,报告荧光基团和淬灭荧光基团的空间距离很近,报告荧光基团发射的荧光信号会被淬灭荧光基团吸收,使仪器检测不到荧光信号。

PCR延伸阶段,Taq DNA 聚合酶沿着模板链从5’3’的方向合成新链,当Taq DNA 聚合酶到达探针结合位点时Taq DNA 聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性将探针5端连接的报告荧光基团切割下来,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而发出荧光,切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比,因此,通过检测PCR反应体系中的荧光强度可以达到检测PCR产物扩增量的目的

QQ图片20200103140524.png

TaqMan 探针法qPCR优点与应用

1、特异性高、定量准确

从原理可以看出,荧光探针只与目的序列结合,理论上探针法的荧光信号只来源于目的序列,即不受非特异性产物的影响,因此,TaqMan探针法qPCR的特异性非常高,定量准确。

2、实验耗时短

TaqMan探针法的高特异性,故无需再设置熔解曲线检测扩增产物的特异性如何大大缩短了实验时间。

3、兼容多重反应

不同波长的荧光报告基团可以标记不同的探针,因此可以在同一个反应体系中利用不同荧光标记的探针同时检测多个靶标,达到节省实验成本的目的。

正是由于上述优点,TaqMan探针qPCR已被广泛应用于生物医药食品等行业的基因检测包括疾病的早期诊断、药物研究、病原微生物检测、转基因食品检测等

QQ图片20200103140641.png 


TaqMan 探针法qPCR局限与注意事项

虽然TaqMan探针法有众多优点,但也有明显的局限性,如探针合成费用较贵,实验成本较高,探针设计难度大等。因此,在进行实验前应注意以下事项:

1、设计引物:引物的GC含量建议在40-60%Tm值在55-60℃。

2、设计探针:

1)探针位置应尽可能的靠近上游引物。

2)探针长度通常在25-35bp,以保证结合的特异性。

3)探针的Tm值在65-70℃,通常比引物的Tm值高510℃,以确保探针与模板结合的稳定程度大于引物与模板结合的稳定程度,GC含量在40-60%

4)探针5'端不应含G,因为5G能够淬灭荧光信号,以避免报告基团的荧光在探针切割后发生淬灭。

5)报告荧光基团及淬灭荧光基团选择:

①选择报告荧光基团时首先要确认激发波长和发射波长与仪器是匹配的。对于多重荧光反应,标记不同探针的报告基团染料的最大发射波长应该至少有15 nm的差异。

②对于淬灭荧光基团,必须要保证其吸收光谱与报告基团的发射光谱有重合。

常用的报告荧光基团及淬灭荧光基团组合见下表:

淬灭荧光基团

报告荧光基团

BHQ/MGB

FAMVICHEXTETJOEROXCY3CY5

TAMRA

FAMVICHEXTETJOE

表:TaqMan报告荧光基团及淬灭荧光基团常用组合

6)为确保引物探针的特异性,最好将设计好的序列在blast中核实一次,发现有非特异性互补区,建议重新设计引物探针

3、确认反应性能:建议用标准曲线确认反应的扩增效率,根据国际公认的MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)指南扩增效率需要达到90%-110%,线性相关性R2> 0.98由于探针是TaqMan实验最昂贵的成分,建议先订购引物,用SYBR Green I反应来确定引物的性能之后再订购TaqMan探针。

到这里,本期关于TaqMan qPCR的内容就介绍完了,如果您还有其他问题,欢迎下方留言!下面墙裂推荐一波Hieff qPCR系列产品,无论您是用SYBR Green I 染料法还是 TaqMan探针法,总有一款适合您哦~

翊圣TaqMan qPCR产品

应用

产品名称

产品货号

反转录

Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)

11141ES60

SYBR Green Ⅰ染料法(通用)

Hifair® qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox )

11201ES08

Hifair® qPCR SYBR® Green Master Mix (Low Rox Plus) 

11202ES08

Hifair® qPCR SYBR® Green Master Mix (High Rox Plus) 

11203ES08

SYBR GreenⅠ染料法(高灵敏)

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法,No Rox)

11198ES08

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法,Low Rox)

11199ES08

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法,High Rox)

11200ES08

SYBR GreenⅠ染料法(高特异)

Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法,No Rox)

11195ES08

Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法,Low Rox)

11196ES08

Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法,High Rox)

11197ES08

TaqMan探针法

Hieff Unicon® qPCR TaqMan Probe Master Mix(单重)

11205ES08

Hieff Unicon® TaqMan multiplex qPCR master mix(多重)

11208ES08

部分高分发表文献

[1]. Han X., et al., Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-Seq[J]. Cell. 2018 Feb 22;172(5):1091-1107.e17. IF 30.410

[2]. JunXiao., et al. Targeting 7-Dehydrocholesterol Reductase Integrates Cholesterol Metabolism and IRF3 Activation to Eliminate Infection[J]. Immunity. 2019 Dec 24. IF 21.522

[3]. Zhu M, Mori M, Hwa T, et al. Disruption of transcription–translation coordination in Escherichia coli leads to premature transcriptional termination[J]. Nature microbiology, 2019: 1-10. IF 14.3

[4]. Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotes cell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244. IF 12.353

[5]. Zhu M, Dai X. Maintenance of translational elongation rate underlies the survival of Escherichia coli during oxidative stress[J]. Nucleic acids research, 2019. IF11.6

[6]. Su G, Guo D, Chen J, et al. A distal enhancer maintaining Hoxa1 expression orchestrates retinoic acid-induced early ESCs differentiation[J]. Nucleic acids research, 2019.IF11.6

[7]. Huang X, He M, Huang S, et al. Circular RNA circERBB2 promotes gallbladder cancer progression by regulating PA2G4-dependent rDNA transcription[J]. Molecular cancer, 2019, 18(1): 166.IF10.679

[8]. Wang Z, Liu C, Zhu D, et al. Untangling the co-effects of oriented nanotopography and sustained anticoagulation in a biomimetic intima on neovessel remodeling[J]. Biomaterials, 2019: 119654.IF10.273


(来源: 上海翊圣生物科技有限公司


全年征稿 / 资讯合作

联系邮箱:kefu@strauss-usa.com不用本金就能赚钱的方法

BANQUANYUMIANZESHENGMING

  • 凡本网注明“来源:来宝网”的所有作品,版权均属于来宝网,转载请必须注明来宝网, http://strauss-usa.com,违反者本网将追究相关法律责任。
  • 本网转载并注明自其它来源的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品来源,并自负版权等法律责任。
  • 如涉及作品内容、版权等问题,请在作品发表之日起一周内与本网联系,否则视为放弃相关权利。


湖南快乐十分 湖南快乐十分 福建快3走势图0 福建快3走势图 河南快3走势图 河南快3走势图 广东11选5开奖结果 福建11选5走势图