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CCK8中文说明书_MedChemExpress

上海皓元生物医药科技有限公司2018年3月26日 14:53 点击:1071

产品概述
Cell Counting Kit-8,简称 CCK-8 试剂盒,是一种基于 WST-8 而广泛应用于
细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒。
CCK-8 溶液可以直接加入到细胞样品中,不需要预配各种成分。WST-8 在
电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色
的formazan  。细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,
则颜色越浅。对于同样的细胞,颜色的深浅 (生成的 formazan 量) 和细胞数
目呈线性关系


细胞活性检测
1. 在96 孔板中接种细胞悬液 (100 ml /孔 ) 。将培养板放在培养箱预培养 (在37 ℃,5% CO2的条件下 )。
2. 向每孔加入10 ml 的CCK- 8溶液 (注意不要在孔中生成气泡,它们会影响 O.D值的读数) 。
3. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。
4. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
5. 如果暂时不测定O.D值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
在 24小时内吸光度不会发生变化。  

细胞增殖 -毒性检测
1. 在96 孔板中配制 100 ml的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养 24小时 ( 在37℃, 5% CO2的条件下 )。
2. 向培养板加入10 ml不同浓度的待测物质。
3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如: 6,12, 24 或48小时 )。    
4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中生成气泡,它们会影响 O.D值的读数) 。
5. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。
6. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
7. 如果暂时不测定O.D值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
在 24小时内吸光度不会发生变化。
注意:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加 CCK-8之前更换新鲜培养基,去掉药物的影响。
当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。  

制作标准曲线
1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞。
2. 按比例 ( 例如:1/2比例 ) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做 3-5个细胞浓度梯度,每组3-6个复孔。
3. 接种后培养2-4 小时使细胞贴壁,然后加 CCK-8试剂培养一定时间后测定 O.D值,制作出一条以细胞数量为横坐标 (X轴) ,O.D值为纵坐标 (Y轴) 的标准曲线。
根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量 (使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致,便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK-8后的培养时间)。



计算公式
细胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%
抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%
As: 实验孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液) ;
Ac: 对照孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液,不含药物) ;
Ab: 空白孔吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液,不含细胞、药物) 。

Cell line : HEK293
Medium : DMEM, 10% FBS
Incubation : 37°C, 5% CO2, 2 hours

Cell line : U87, SK-HEP1
Medium : DMEM, 10% FBS
Chemicals : 200 μM Cisplatin (DDP)
Incubation : 37°C, 5% CO2, 2 hours

注:如果待测药物有氧化性或还原性,可在加入 CCK-8 之前更换新鲜培养
基,去掉待测药物的影响。当待测药物影响比较小的情况下可以不更换培
养基,直接扣除培养基中加入待测药物后的空白吸收即可。
WST-8 是 MTT 的一种升级替代产品,和 MTT 或其它 MTT 类似产品,如
XTT、MTS 等相比有明显的优点。
第一,MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原
生成的 formazan 不是水溶性的,需要有特定的溶剂来溶解;而 WST-8 和
XTT 、MTS 产生的 formazan 都是水溶性的,可以省去后续的溶解步骤。
第二,WST-8 产生的 formazan 比 XTT 和 MTS 产生的 formazan 更易溶解。
第三,WST-8 比 XTT 和 MTS 更加稳定,使实验结果更可靠。
第四,WST-8和 MTT、XTT 等相比线性范围更宽,灵敏度更高,并且更加稳定。
WST-8 对细胞无明显毒性。加入 CCK-8 溶液显色后,可以在不同时间反复
用酶标仪读板,检测时间更加灵活,便于确定最佳测定时间。

注意事项
1. CCK-8 的培养时间一般为 1-4 小时,但在培养 30 分钟左右即可取出肉眼
观察显色程度,根据细胞种类而定,需要摸索条件,CCK-8 的最佳反应时
间以具体显色的最佳时间为准。
2. 使用 96 孔板进行检测时,如果细胞培养时间较长,一定要注意蒸发问
题。一方面,由于 96 孔板周围一圈最容易蒸发,可以采取弃用周围一圈
的办法,改加相同量的 PBS 、水或培养液;另一方面,可以把 96 孔板置
于靠近培养箱内水源的地方,以缓解蒸发。
3. 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应,所以还原剂 (例如一些抗氧
化剂) 会干扰检测,如果待检测体系中存在较多的还原剂,需设法去除。
用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡,否则会干扰测定。
4. 加入药物中如含有金属,对 CCK-8 显色有影响。终浓度为 1 mM 的氯化
亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5% 、15% 、90% 的显色反应,使灵敏度降
低。如果终浓度是 10 mM 的话,将会 100% 抑制。
5. 培养基中的酚红不会影响实验结果,酚红的吸光度可以在计算时,通过
扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。
6. 本产品可以检测 ,但不能检测酵母细胞。向 100 μL 培养液
中加入 10 μL CCK-8 溶液,并培养 1-4 小时或过夜。
7. CCK-8 试剂对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶
液颜色不断加深,OD 值不断增加 (注: 活细胞内的脱氢酶是持续产生的) 。
8. 要测定细胞的具体数量,建议同时做标准曲线。
9. 建议采用多通道移液器,以减小平行孔间的差异。
10. 以下方法可以终止 CCK-8 反应 (96 孔板) :
(a). 在显色反应后,将培养板放置 4°C 冰箱内。(b). 每孔加 10 μL 0.1 M HCl
溶液。(c). 每孔加 10 μL 1% (w/v) 的 SDS (十二烷基硫酸钠) 溶液。
注意:反应停止后,应在 24 小时内测定。
11. 本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不
得用于食品或药品。
不用本金就能赚钱的方法12. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

(来源: 上海皓元生物医药科技有限公司


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