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活细胞工作站、共聚焦显微镜研究蛋白激酶D在UDP诱导的小神经胶质细胞胞吞和胞饮作用中的功能

汇佳生物仪器(上海)有限公司2013年4月12日 10:39 点击:1058

利用CV1000高端活细胞工作站研究蛋白激酶D在UDP诱导的小神经胶质细胞胞吞和胞饮作用中的功能

概述:CV1000高端活细胞工作站是6D、长时程的活细胞观察的最佳工具,结合zeiss共聚焦显微镜进行研究。小神经胶质细胞是一类在中枢神经系统(CNS)中发现的免疫活性细胞,他们可以迅速地对生物刺激做出反应并执行免疫功能,他们甚至可以转移至细胞中,高度繁殖且产生一些列的免疫介质。即使在健康状态,他们也会重复延伸和收缩运动不停地在自己的区域内搜索危险信号;在中枢神经系统中,小神经胶质细胞能够对脑实质进行持续不断的监视并且利用细胞外核苷酸的刺激引发它们的动态反应,可以这样说,小神经胶质细胞对组织碎片的清除对维持脑的内稳态有着至关重要的作用。小神经胶质细胞的功能会受到胞外以及胞内很多因子的调控,ATP,ADP, UDP等核苷酸因其可以在一些机体中展现出调节不同的免疫反应的功能而受到研究者的关注。通常情况下,细胞内含有高浓度的核苷酸,而胞外极低,若细胞受损,核苷酸由胞内的高浓度向胞外渗漏,并且会与胞外的嘌呤受体发生反应。已有报道,受损神经元泄露或释放的细胞外尿苷二磷酸(UDP)通过P2Y6受体活化来激发小神经胶质细胞的吞噬作用。然而,小神经胶质细胞与P2Y6受体信号的细胞内潜在机制还不清楚。 下面介绍的实验揭示了P2Y6受体的激活对于小神经胶质细胞对胞外微粒体的吞食有着促进作用。 实验具体结果如下:UDP能够在细胞膜上即时引发并持续长时间的小神经胶质细胞动态反应。UDP刺激60分钟后,细胞内包含有本位于胞外且被荧光蛋白标记的葡聚糖的液泡数量增多,这意味着胞饮作用的发生。此外,UDP诱导形成的液泡和细胞膜流动性的持续性增加还可被PKD(蛋白激酶D)的抑制剂所抑制,UDP 可以快速的诱导PKD的磷酸化以及膜转运,如果使用PKC(蛋白激酶C)的抑制剂Go6983,可使此磷酸化及膜转运终止,但Go6983却无法抑制UDP诱导的微球形成,然而另一抑制剂CID755673可以明显的抑制UDP诱导形成的对IgG毒素调理微球的吞饮作用。上述的数据揭示了PKD所调节的UDP诱导的膜运动是独立于PKC途径的,同时它也对小神经胶质细胞对液体以及微球的胞吞胞饮作用有着上调的作用。

 
实验目的: 揭示蛋白激酶D在UDP诱导的小神经胶质细胞胞吞和胞饮作用中的功能
 
实验仪器和试剂:CV1000 Cell Voyager (YOKOGAWA)活细胞工作站,ZEISS 荧光显微镜共聚焦,UDP, PMA(PKC,PKD磷酸化激活剂),CID、 Go6983、Go6976(PKC不同亚型的抑制剂)

 
实验对象:小神经胶质细胞
 

实验步骤

 
1.PKD的抑制对UDP诱导形成的液泡的影响。
小神经胶质细胞先用各类PKC,PKD抑制剂孵育10分钟,之后用UDP诱导60分钟,观察液泡的形成和数量的变化,实验结果看图1。


图1

实验1总结: PKC/PKD抑制剂Go83对液泡无影响,Go76和CID可显著抑制液泡的形成。

 
2. PDK抑制剂对葡聚糖的胞吞以及水溶性β-淀粉的吞噬的影响。

图2
 
 
FITC-葡聚糖(绿色),Fluo555-β淀粉(红色)直接加入细胞培养基中,之后细胞用UDP或(CID+UDP)孵育60分钟,之后HBSS洗涤细胞5次,洗去培养基中残留的葡聚糖和淀粉。这部分图片由共聚焦拍摄而成。
 
实验2总结: 在UDP的诱导下,可看到小神经胶质细胞会出现增强的胞吞作用(与对照组相比较);而CID抑制剂的存在会抑制胞吞。
 
3.UDP诱导的PKD磷酸化以及膜转运。

 A:100uMUDP诱导不同时间的细胞以及PMA(100nM)诱导15分钟的细胞,分别在诱导后裂解以及注入WESTERN磷酸化抗体检测PKD磷酸化情况;
B: 不同浓度的UDP诱导细胞3分钟后,洗去诱导剂,裂解细胞并WESTERN检测PKD的磷酸化;
C: 经100uM UDP不同时间(1min,15min,60min)诱导,以及PMA(100nM)15min诱导的小神经胶质细胞,固定并染色,在共聚焦下观察PKD的细胞分布。
 

实验3总结:A: 在UDP1-45min的刺激时间段内,PKD两个位点的磷酸化都有增强,PMA也在两个位点促进了磷酸化。B:UDP对PKD的磷酸化促进作用呈现出剂量依赖的方式。C:PKD在UDP诱导1min时,开始在细胞膜处聚集,而此处也同时聚集着F-actin;诱导 10min后,PKD开始向液泡边缘聚集,并持续到60min诱导的细胞中,与阳性对照PMA诱导组的细胞分布状态相同。
 
4.PKC/PKD抑制剂对UDP诱导的PKD激活的影响。

实验通过检测UDP激活PKD后的磷酸化以及膜转运和液泡行程的情况:
 

 
A: 细胞先由三种PKC/PKD抑制剂预处理10min,之后加入UDP(100uM)诱导3min, Western 检测PKD 的磷酸化情况;
B: 细胞先由三种PKC/PKD抑制剂预处理10min,之后UDP(100uM)诱导1min,固定并做细胞染色,共聚焦观察F-actin,PKD与细胞核相比较的定位分布,进而分析PKD的膜转运分布;
C: 细胞先由三种PKC/PKD抑制剂预处理10min,之后UDP(100uM)诱导60min,待液泡形成后,比较四组实验中的液泡行程情况。
 
实验4 总结: A:Go83(1uM)可一直PKD在Ser744的磷酸化,而Go76(1uM)和CID(50uM)却对其磷酸化无影响;B: PKD的质膜转运和肌动蛋白的质膜聚集可被Go831uM)抑制,可被Go76(1uM)和CID(50uM)部分抑制;C: 肌动蛋白的质膜聚集并不三种抑制剂的影响,但在CID抑制剂存在的细胞中,液泡的形成也受到了抑制,其他抑制剂对液泡及肌动蛋白均无明显影响。

 
5.PKC/PKD抑制剂对UDP诱导的微粒体吞噬的影响。

细胞先由三种PKC/PKD抑制剂预处理10min,之后加入UDP(100uM)诱导60min, 荧光显微镜观察细胞形态变化。
 

 
实验5总结:UDP诱导形成的微粒体吞噬,Go83(1uM)对其没有影响,而Go76(1uM)和CID(50uM)均可抑制其形态上的变化。
 
结论:总结上述一系列实验结果,UDP可诱导小神经胶质细胞在对外来免疫活性物质应对性的产生液泡,并上调PKD的磷酸化并促进其质膜转运,但这些调控似乎与PKC/PKD各亚型磷酸化抑制剂并无直接关系;所以推论UDP 可诱导与PKC途径无关的PKD磷酸化与膜转运,且此途径与小神经胶质细胞的吞噬作用无关;但在持续的细胞膜运动和液泡形成过程中,此PKC独立的PKD激活途径参与其中,并可促进小神经胶质细胞的胞吞和胞饮作用。
 
对于小神经胶质细胞胞吞作用中PKD 的功能研究上,一直存在争议,此篇文章采用了活细胞动态分析的实验技术是一大亮点,YOKOGAWA 的活细胞动态观察系统CV1000 完成了此文章中大部分的动态捕捉视频,使得数据的可靠性真实性大大提高。


 

(来源: 汇佳生物仪器(上海)有限公司


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