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Hieff NGS® MaxUp II Dual-mode mRNA Library Prep Kit for MGI® MaxUp II 13331ES16
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Hieff NGS® MaxUp II Dual-mode mRNA Library Prep Kit for MGI® MaxUp II 13331ES16

产品报价:4563元 不用本金就能赚钱的方法

更新时间:2020/2/24 14:31:40

地:上海

牌:翊圣生物

号:13331ES16

厂商性质: 生产型,贸易型,服务型,

公司名称: 上海翊圣生物科技有限公司不用本金就能赚钱的方法

产品关键词: 液体电阻率测试仪   粉体电阻率测试仪   绝缘材料电阻测试仪   直流绝缘电阻测试仪   塑料电阻率测试仪  

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产品信息

产品名称

产品编号

规格

价格(元)

Hieff NGS? MaxUp II Dual-mode mRNA Library Prep Kit for MGI?

MaxUp II 双模式mRNA 建库试剂盒

13331ES16

16 T

4563.00

13331ES96

96 T

22563.00

产品描述

Hieff NGS? MaxUp II Dual-model mRNA Library Prep Kit for MGI?是针对MGI?高通量测序平台专门研发的用于mRNA转录组文库构建试剂盒,本试剂盒cDNA二链合成EndprepdA-tailing进行合并,极大地缩减建库时间。二链合成模块配有两种buffer,客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。本产品适用于起始模板为0.1-4μg不同来源真核生物总RNA样本。经过mRNA分离、片段化、双链cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增,总RNA样品最终转化为适用于MGI?平台测序的文库。

试剂盒包含个独立模块,BOX-I的核心为纯化mRNA所需的oligo(dT)磁珠。BOX-II包含mRNA片段化试剂,反转录试剂,常规和链特异性dscDNA合成,以及后续建库所需的所有试剂。其中链特异性二链合成buffer中将dTTP替换为dUTP,使cDNA第二链中掺入dUTP,而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板,实现链特异性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

产品组分

QQ图片20191230173815.png


运输与保存方法

冰袋运输。效期一年。存储温度如下,切不可搞错!

Box I2-8℃保存Box II-20℃保存

注意事项

一、 关于操作

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4. 请使用无RNase污染的耗材,并对实验区域定期进行清理,推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;配备文库构建专用移液器等设备;定时对各实验区域进行清洁(推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾),以保证实验环境的洁净度。

二、应用范围

本试剂盒适用于起始模板量为0.1-4 μg(体积≤50 μL)的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低,体积超过50 μL,可使用Hieff NGS? RNA Cleaner磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测,RIN值要求>7,以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。

本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo (dT)磁珠,只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取;其他不具poly(A)尾的RNA,如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外,FFPE样本中的mRNA降解严重,通常无完整的poly(A)尾结构,故亦无法使用本试剂盒进行建库。

本试剂盒所制备文库可进行多种RNA-Seq应用,包括:

基因表达(gene expression

单核苷酸变异检测(single nucleotide variation discovery

基因融合鉴定(gene fusion identification

剪切变异体分析(splice variant analysis

三、关于接头连接(Adapter Ligation

1. 目前华大智造2种序号的接头:1-128501-596。关于其使用要求,请详见华大智造“关于Adapter使用”有关说明或咨询本公司。此外,华大智造申明:2种接头由于设计工艺不同,禁止混用,否则测序数据无法拆分!

2. 我们建议选用高质量的商业化接头,如客户使用自制接头,请委托具有NGS引物合成经验的公司,并备注需进行严格的防污染控制。此外,进行接头退火操作时,请在超净台完成。每次只操作一种接头,防止交叉污染。

3. 建库过程中,接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中,所加入的接头体积固定为5 μL,请根据初始的RNA投入量,参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer,稀释过的接头可在4°C保存48小时。

1  Input Total RNA量与接头浓度推荐表

Input Total RNA

Adapter stock concentration

100–499 ng

2 μM

500–4000 ng

5 μM

四、关于磁珠纯化与分选(Bead-based Clean Up and Size Selection

1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠,我们推荐使用Hieff NGS? DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)AMPure? XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。

5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脱,产物于4°C可保存2-20°C可保存1个月。

五、关于文库扩增(Library Amplification

1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成,在第一代的基础上,大大增强了扩增的均一性,即使是低拷贝的基因,也能进行无偏好性地扩增。

2. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增,Input Total RNA量与相应扩增循环数的推荐。

2  Input Total RNA量与扩增循环数推荐表*

Input Total RNA

Number of cycles

Non-stranded

Stranded

100 ng

12-14

14-16

1000 ng

10-12

12-14

2000 ng

8-10

10-12

【注】:*由于不同物种和组织所提取的Total RNA中,mRNA的含量差异较大实验中需根据建库起始量、物种类型及样本处理情况适当调整扩增循环数。

六、关于文库质检(Library Quality Analysis

1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit?PicoGreen?等;基于qPCR绝对定量的方法。

3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit?等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物;qPCR绝对定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop?等。

5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

使用方法

一、自备材料

1. 纯化磁珠:Hieff NGS? DNA Selection BeadsCat#12601)或AMPure XP BeadsCat#A63880)或其他等效产品。

2. RNA质控:Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。

3. Adapters详情请咨询华大智造或本公司

4. 文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品;文库定量试剂。

5. 其他材料:无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

 

二、操作流程

QQ图片20191230173955.png 


三、操作步骤

3.1 mRNA纯化和片段化(mRNA Purification and Fragmentation

1. mRNA Capture Beads2-8℃取出,静置使其温度平衡至室温,约30 min

2. 准备一个Nuclease free离心管,0.1-4 μgRNA,用Nuclease free水将体积补至50 μL,冰上放置备用。

3. 颠倒或旋涡振荡混匀磁珠,吸取50 μL磁珠悬液加入至50 μLRNA样品中,用移液器吹打6次,使其充分混匀。

4. 将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中,65℃5 min4℃hold,使得RNA变性。

5. 室温孵育5 min,使mRNA与磁珠完全结合。

6. 将样品置于磁力架中,室温静置5 min,使mRNA与总RNA分离,小心移除上清。

7. 将样品从磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠,移液器反复吹打6次以彻底混匀。将样品置于磁力架中,室温静置5 min,小心移除上清。

8. 重复步骤7,共洗涤两次。

9. 将样品从磁力架上取出,加入50 μL Tris Buffer重悬磁珠,用移液器反复吹打6次以彻底混匀。

10. 将样品置于PCR仪中,80℃2 min25℃hold,将mRNA洗脱下来。

11. 将样品从PCR仪中取出,加入50 μL Beads Binding Buffer,用移液器反复吹打6次以彻底混匀。

12. 室温放置5 min,使mRNA结合到磁珠上。

13. 将样品置于磁力架中,室温静置5 min,小心移除上清。

14. 将样品从磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠,移液器反复吹打6次以彻底混匀,将样品重新放回至磁力架中,室温静置5 min,吸掉全部上清。

【注】:最后需要用10 μL移液器吸干净残留液体。

15. 将样品从磁力架上取出,用18.5 μL Frag/Prime buffer重悬磁珠,用移液器吹打6次以彻底混匀;将样品置于PCR仪中(预设为94℃85),可参考表3选择片段化程序,但不同物种片段化的效果有差异,客户可先根据自己的情况,做个片段化时间的梯度,比如94℃,5 min85℃,6 min。使用Agilent 2100分析双链cDNA纯化产物大小

3  mRNA片段化程序选择

插入片段大小(bp

打断程序

150-200

94°C6 min

200-300

94°C5 min

250-450

85°C8 min

400-550

85°C6 min

16. 片段化程序结束后,为防止poly(A)RNA与磁珠结合,请立即将样品置于磁力架中,待溶液澄清后,转移17 μL上清至一个新的nuclease free离心管中,立刻进入第一链合成反应。

3.2 第一链cDNA的合成:

1. 第一链合成试剂-20°C取出,颠倒混匀后瞬离。按表4所示,配制第一链cDNA合成的反应液

4  第一链cDNA合成反应体系

名称

体积(μL

Fragmented mRNA

17

Strand Specificity Reagent

6

1st Strand Enzyme Mix

2

2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表5所示设置反应程序,进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。

5  第一链cDNA合成反应程序

温度

时间

热盖 105°C

On

25°C

10 min

42°C

15 min

70°C

15 min

4°C

Hold

3.3第二链cDNA的合成/末端修复/A

1. 第二链合成试剂-20 °C取出,解冻后颠倒混匀;按照表6所示,配制第二链cDNA合成/末端修复/A反应液。

6 第二链cDNA合成反应体系

名称

体积(μL

1st Strand cDNA

25 μL

2nd Strand Buffer ( dNTP or dUTP)*

30 μL

2nd Strand Enzyme Master Mix

5 μL

【注】:*如构建普通mRNA文库,请使用含dNTPbuffer;如构建链特异性mRNA文库,请使用含dUTPbuffer

2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表7所示设置反应程序,进行第二链cDNA的合成。

 

 

 

 

7  第二链cDNA合成反应程序

温度

时间

热盖 105°C

on

16°C

30 min

72°C

15 min

4°C

Hold

3.4 接头连接(Adapter Ligation

该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端,连接特定的MGI?接头。

1. 参考注意事项三中的表1,根据Input RNA量,稀释Adapter至合适浓度。

2. 将表8中各试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

3. 3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表8所示反应体系。

8  Adapter Ligation体系

名称

体积(μL

dA-tailed DNA

60

Ligation Enhancer

30*

Fast T4 DNA Ligase

5

DNA Adapter

5**

【注】:*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡,充分混匀并瞬时离心后使用。

**请根据注意事项三中表1的提示,用0.1×TE buffer对接头进行稀释,接头体积固定为5 μL

4. 使用移液器轻轻吹打混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

5. PCR管置于PCR仪中,设置表9所示反应程序,进行接头连接反应:

9  Adapter Ligation反应程序

温度

时间

热盖

Off

20°C

15 min

4°C

Hold

【注】:当Input DNA量较低时,可尝试将连接时间延长一倍,这将提高连接效率。

3.5 连接产物纯化和片段大小分选(Post Ligation Clean Up and Size Selection

目前有两个方案应用于该步骤,当插入片段<200 bp时,使用方案A;当插入片段≥200 bp时,使用方案B

方案A:适用于插入片段150-200 bp的文库(mRNA打断方案为94°C6 min

1. 准备工作:将Hieff NGS? DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取60 μL Hieff NGS? DNA Selection Beads0.6×Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min

4. PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. PCR管从磁力架中取出,加入102 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,准备进行第二轮纯化。

9.  吸取80 μL Hieff NGS? DNA Selection Beads0.8×Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min

10. PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

11. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

12. 重复步骤5,总计漂洗两次。

13. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

14. PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中进行PCR扩增。

方案B:适用于插入片段大于200 bp的文库(mRNA打断方案为94°C5 min85℃,8 min

方案B-1:接头连接产物的纯化

1. 准备工作:将Hieff NGS? DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取80 μL Hieff NGS? DNA Selection Beads0.8×Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min

4. PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. PCR管从磁力架中取出,加入102 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,准备进行双轮分选。

【注】:Ligation Enhancer中含有的高浓度PEG会对磁珠双轮分选产生影响,所以必须经过一轮纯化后再进行双轮分选。

方案B-2双轮分选

1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

2. 根据DNA片段长度要求,参考表10,在上述100 μL DNA中加入第一轮分选磁珠,涡旋或移液器吹打10次混匀。

10  文库分选推荐磁珠比例

DNA文库插入片段大小(峰值,bp

~ 200

~ 300

~ 400

~ 500

打断条件

94℃,5 min

85℃,8 min

85℃,8 min

85℃,6 min

  接头连接之后分选或文库扩增之后分选

第一轮体积比

0.78×

0.68×

0.58×

0.4

第二轮体积比

0.20×

0.20×

0.20×

0.20×

【注】:此表推荐的双轮分选比例适用于AMPure? XP磁珠和Hieff NGS? DNA Selection Beads;表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为200 bp时,若在接头连接之后分选,样品DNA体积为100 μL,则第一轮分选磁珠使用体积为0.78×100 μL=78 μL第二轮分选磁珠使用体积为0.20×100 μL=20 μL

3. 室温孵育5 min

4. PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移上清到干净的离心管中,残留1-2 μL溶液于管底。

5. 参考表10向上清中加入第二轮分选磁珠。

6. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5 min

7. PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

8. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。

9. 重复步骤8

10. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约5 min)。

11. PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min

12. PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移20 μL上清至干净管中。

3.6文库扩增(Library Amplification

该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

1. 将表11中的试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用

2. 于无菌PCR管中配制表11所示反应体系。

11  接头连接产物PCR反应体系

组分名称

体积(μL

Ultima HF Amplification Mix

25

Primer Mix for MGI?

5

Adapter Ligated DNA

20

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

4. PCR管置于PCR仪中,设置表12示反应程序,进行PCR扩增

12  PCR扩增反应程序

温度

时间

循环数

98°C

1 min

1

98°C

10 sec

参照表2(注意事项五)

60°C

30 sec

72°C

30 sec

72°C

5 min

1

4°C

Hold

-

3.7 扩增产物磁珠纯化或分选(Post Amplification Clean Up/Size Selection

3.5步骤中纯化操作步骤。使用Hieff NGS? DNA Selection Beads0.9×Beads:DNA=0.9:1)纯化文库扩增产物。

3.8 文库质量控制

通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项六。

3.9 文库环化

使用Hieff NGS? Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI?Cat#13341)或其他等效产品进行文库单链环化反应。

附录一:mRNA片段化

QQ图片20191230174636.png 






 

 

 

 

 

                                                                                      

                                                                                

                                                                                    

 

                                                                                

 

 

 


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